Métodos laboratoriais utilizando anticorpos

Fonte: Livro Imunologia Celular e Molecular - 8ª Ed.

Autores: Abul Lichtman, Andrew Abbas

A requintada especificidade dos anticorpos para antígenos particulares torna os anticorpos valiosos reagentes para a detecção, purificação e quantificação dos antígenos. Pelo fato de os anticorpos poderem ser produzidos contra virtualmente qualquer tipo de macromoléculas e pequenas moléculas químicas, as técnicas baseadas em anticorpos podem ser usadas para estudar virtualmente qualquer tipo de molécula em solução ou nas células. O método para a produção de anticorpos monoclonais (Cap. 5) aumentou significativamente nossa habilidade em gerar anticorpos de quase qualquer especificidade desejada. Historicamente, muitos dos usos dos anticorpos dependiam da habilidade do anticorpo e da especificidade do antígeno em formar grandes imunocomplexos, ou em solução ou em géis, que pudessem ser detectados por vários métodos óticos. Estes métodos foram de grande importância nos estudos iniciais, mas atualmente foram substituídos quase que completamente por métodos mais simples baseados em anticorpos ou antígenos imobilizados.

 Quantificação de Antígeno por Imunoensaios 

Métodos imunológicos de quantificação da concentração de antígeno fornecem sensibilidade e especificidade extraordinárias e se tornaram técnicas-padrão para ambas as pesquisas e aplicações clínicas. Todos os métodos imunoquímicos de quantificação são baseados em ter um antígeno ou anticorpo puro cujas quantidades podem ser medidas por uma molécula indicadora (ou um marcador). Quando o antígeno ou anticorpo é marcado com um radioisótopo, como primeiramente introduzido por Rosalyn Yalow et al., ele pode ser quantificado por instrumentos que detectam os eventos de decaimento radioativo; o ensaio é denominado radioimunoensaio (RIA, do inglês radioimmunoassay). Quando o antígeno ou anticorpo é acoplado covalentemente a uma enzima, ele pode ser quantificado pela determinação, com um espectrofotômetro, da taxa na qual a enzima converte um substrato límpido em um produto colorido; o ensaio é denominado ensaio imunossorvente ligado à enzima (ELISA, do inglês enzyme-linked immunosorbent). Existem várias variações no RIA e no ELISA, porém a versão mais comumente utilizada é o ensaio em sanduíche (Fig. A-1). Este ensaio usa dois anticorpos diferentes reativos com diferentes epítopos em um antígeno cuja concentração necessita ser determinada. Uma quantidade fixa de um anticorpo é ligada a uma série de réplicas em suporte sólido, tais como placas plásticas de micropoços. As soluções de teste contendo o antígeno em concentração desconhecida ou uma série de soluções-padrão com concentrações conhecidas do anticorpo são adicionadas aos poços e deixadas aderir. O antígeno não ligado é removido por lavagem, e um anticorpo secundário, que é uma enzima ligada ou radiomarcada, é adicionado também para aderir. O antígeno serve como uma ponte, de tal forma que quanto mais antígeno houver em solução ou nas soluções-padrão, mais enzima ligada ou anticorpo secundário radiomarcado irá se ligar. Os resultados das soluções-padrão são utilizados para construir uma curva de ligação para o anticorpo secundário como uma função da concentração do antígeno, da qual as quantidades de antígeno nas soluções em teste podem ser inferidas. Quando este teste é realizado com dois anticorpos monoclonais, é essencial que esses anticorpos não se sobreponham aos determinantes no antígeno; de outra forma, o anticorpo secundário não poderá se ligar.

 FIGURA A-1 Ensaio do sanduíche imunossorvente ligado à enzima ou radioimunoensaio. Uma quantidade fixa de um anticorpo imobilizado é utilizada para capturar o antígeno.

 Aligação de um segundo anticorpo marcado que reconhece um determinante sobreposto no antígeno aumentará à medida que a concentração do antígeno aumenta se eleva e, então, permite a quantificação do antígeno. Em uma importante variação clínica dos ensaios de imunoligação, amostras de pacientes podem ser detectadas para a presença de anticorpos que são específicos para o antígeno microbiano (p. ex., anticorpos reativos com proteínas do vírus da imunodeficiência humana [HIV] ou vírus da hepatite B) como indicadores da infecção. Nestes casos, uma quantidade saturante de antígeno é adicionada para poços replicados e contendo anticorpo ligado, ou o antígeno é adicionado diretamente na placa, e diluições seriadas do soro do paciente são então adicionadas. A quantidade de anticorpo do paciente que se liga ao antígeno imobilizado é determinada pelo uso de um anticorpo anti-imunoglobulina (Ig) humana ligado à enzima ou radiomarcado.

Identificação e Purificação de Proteínas 

Anticorpos podem ser usados para identificar e caracterizar proteínas e para purificar proteínas específicas em misturas. Dois métodos comumente utilizados para identificar e purificar proteínas são a imunoprecipitação e a cromatografia por imunoafinidade. O Western blotting é uma técnica amplamente utilizada para determinar a presença e o tamanho de uma proteína em uma amostra biológica.

 Imunoprecipitação e Cromatografia por Imunoafinidade

 A imunoprecipitação é uma técnica na qual um anticorpo específico para um antígeno proteico em uma mistura de proteínas é usado para identificar este antígeno específico (Fig. A-2, A). O anticorpo é tipicamente adicionado à mistura de proteína (normalmente um lisado detergente de células específicas), e uma proteína A estafilocócica (ou proteína G) covalentemente ligada a partículas de agarose é adicionada na mistura. As porções Fab do anticorpo se ligam às proteínas-alvo, e a porção Fc do anticorpo é capturada pela proteína A ou proteína G nas partículas. Proteínas indesejadas que não se ligam ao anticorpo são, então, removidas com lavagens das partículas (por adição repetitiva de detergente e centrifugação). A proteína específica que é reconhecida e agora ligada ao anticorpo pode ser eluída das partículas e dissociada do anticorpo com o uso de uma solução desnaturante (p. ex., sódio dodecil sulfato) e as proteínas são separadas por eletroforese em gel de poliacrilamida-sódio dodecil sulfato (SDS-PAGE). As proteínas podem ser detectadas após a eletroforese com coloração do gel de poliacrilamida com um corante de proteína ou com análise do Western blot (descrito mais adiante). Se a mistura original contiver proteínas marcadas radioativamente, as proteínas específicas imunoprecipitadas pelo anticorpo podem ser reveladas por autofluorografia ou autorradiografia, com as bandas proteicas sendo capturadas em um filme de raios X colocado no gel SDS-poliacrilamida seco e contendo as proteínas separadas.

 FIGURA A-2 Isolamento de um antígeno por imunoprecipitação ou cromatografia por afinidade. A, Um antígeno particular pode ser purificado a partir de uma mistura de antígenos no soro ou em outras soluções através da adição de anticorpos específicos para o antígeno que estão ligados a partículas insolúveis. Os antígenos não ligados são lavados e o antígeno desejado é recuperado por alteração no pH ou força iônica da solução, de tal forma que a afinidade da ligação antígenoanticorpo é reduzida. Aimunoprecipitação pode ser usada como meio de purificação, como meio de quantificação ou como meio de identificação de um antígeno. Antígenos purificados por imunoprecipitação frequentemente são analisados por eletroforese em gel de sódio dodecil sulfatopoliacrilamida. B, Cromatografia por afinidade é baseada no mesmo princípio da imunoprecipitação, exceto que o anticorpo é fixado a uma matriz ou partículas insolúveis, normalmente uma coluna. O método frequentemente é usado para isolar antígenos solúveis (mostrado) ou anticorpos específicos para um antígeno imobilizado.

A cromatografia por imunoafinidade, uma variante da cromatografia por afinidade, é um método de purificação que se baseia nos anticorpos ligados a um suporte insolúvel para purificar antígenos a partir da solução (Fig. A-2, B). Anticorpos específicos para um antígeno desejado são tipicamente ligados covalentemente a um suporte sólido, tais como partículas de agarose, e empacotados dentro de uma coluna. Uma complexa mistura de antígenos é passada através das partículas para permitir que o antígeno que é reconhecido pelo anticorpo possa se ligar. Moléculas não ligadas são lavadas, e o antígeno ligado é eluído com a troca do pH ou pela exposição de muito sal ou outras condições caotróficas que quebram as interações antígeno-anticorpo. Um método similar pode ser usado para purificar anticorpos de sobrenadantes de culturas ou fluidos naturais, tais como soro, primeiramente com ligação do antígeno às partículas e passagem dos sobrenadantes ou soro.

Western blotting 

O Western blotting (Fig. A-3) é usado para identificar e determinar a quantidade relativa e o peso molecular de uma proteína dentro de uma mistura de proteínas ou outras moléculas. A mistura é primeiramente submetida à separação analítica, tipicamente por SDS-PAGE, de tal forma que as posições finais de diferentes proteínas no gel ocorrem em função de seus tamanhos moleculares. A matriz de proteínas separadas é, então, transferida do gel de separação de poliacrilamida para um suporte de membrana por eletroforese, de maneira que a membrana adquire uma réplica do padrão das macromoléculas separadas e presentes no gel. O SDS é deslocado da proteína durante o processo de transferência, e os determinantes antigênicos nativos são frequentemente recuperados como dobras das proteínas. A posição do antígeno proteico na membrana pode, então, ser detectada com a ligação de um anticorpo não marcado específico para aquela proteína (o anticorpo primário) seguido por um anticorpo secundário marcado e que se liga ao anticorpo primário. Este procedimento fornece informações sobre o tamanho do antígeno e sua quantidade. Em geral, os marcadores dos anticorpos secundários são marcados com enzimas que geram sinais de quimioluminescência e deixam imagens em filme fotográfico. Fluoróforos de infravermelho também podem ser usados para marcar os anticorpos, e a luz produzida pela excitação do fluoróforo fornece uma quantificação do anticorpo mais apurada quando comparado com anticorpos secundários ligados à enzima. A sensibilidade e especificidade desta técnica podem ser aumentadas com uso de proteínas imunoprecipitadas em vez de misturas de proteínas brutas. Este procedimento sequencial é especialmente útil para a detecção de interações proteína-proteína. Por exemplo, a associação física de duas proteínas diferentes na membrana de um linfócito pode ser estabelecida pela imunoprecipitação de um extrato de membrana com uso de um anticorpo específico para uma das proteínas e marcação do Western blot do imunoprecipitado utilizando um anticorpo específico para a proteína secundária que pode ser coimunoprecipitada juntamente à primeira proteína.

 FIGURA A-3 Caracterização de antígenos por Western blotting. 
Antígenos de proteínas, separados por eletroforese em gel de sódio dodecil sulfato (SDS)- poliacrilamina e transferidos para uma membrana, podem ser detectados por um anticorpo que é revelado por um anticorpo secundário que pode estar conjugado a uma enzima, como a horseradish peroxidase, ou a um fluoróforo.

 A técnica de transferência das proteínas do gel para a membrana é chamada de Western blotting como uma brincadeira do bioquímico. Southern é o último nome do cientista que primeiro fez um blot de DNA separando um gel para uma membrana por transferência capilar, uma técnica desde então denominada como Southern blotting. Por analogia, o Nothern blotting foi o termo aplicado à técnica de transferência de RNA de um gel para uma membrana e Western blotting é o termo utilizado para descrever a transferência de proteínas para a membrana.

Marcação e Detecção de Antígenos em Células e Tecidos 

Anticorpos específicos para antígenos expressos em tipos celulares particulares são comumente utilizados para identificar essas células em tecidos ou suspensões celulares e para separar estas células de populações misturadas. Nestes métodos, o anticorpo pode ser marcado com radioatividade, ligado à enzima ou, mais comumente, marcado com fluorescência e um sistema de detecção é usado para identificar o anticorpo ligado. Anticorpos ligados a partículas magnéticas podem ser utilizados para isolar fisicamente células que expressam antígenos específicos.

Citometria de Fluxo e Separação de Células Ativadas por Fluorescência 

A linhagem tecidual, o estado de maturação ou o estado de ativação de uma célula frequentemente podem ser determinados pela análise da superfície celular ou expressão intracelular de diferentes moléculas. Esta técnica é comumente usada para coloração da célula com marcadores fluorescentes que são específicos para aquelas moléculas e medida da quantidade de fluorescência emitida pela célula (Fig. A-4). O citômetro de fluxo é um instrumento especializado que pode detectar a fluorescência de células individuais em uma suspensão e, assim, determinar o número de células que expressam a molécula à qual o marcador fluorescente se liga. Suspensões de células são incubadas com marcadores fluorescentes, e a quantidade de marcador ligado a cada célula na população é medida com a passagem das células individuais através do fluorímetro com um feixe incidente de laser. As quantidades relativas de uma molécula em particular em diferentes populações de células podem ser comparadas com coloração de cada população com o mesmo marcador e determinação da quantidade de fluorescência emitida. Na preparação para a análise por citometria de fluxo, as suspensões celulares são coradas com os marcadores fluorescentes de escolha. Mais frequentemente, esses marcadores são anticorpos marcados com fluorocromo específicos para uma molécula da superfície celular. Alternativamente, as moléculas citoplasmáticas podem ser coradas em células temporariamente permeabilizadas, permitindo que os anticorpos marcados entrem através da membrana plasmática. Em adição aos anticorpos, vários indicadores fluorescentes das concentrações citoplasmáticas de íons e potencial de redução-oxidação podem ser detectados por citometria de fluxo. Estudos de ciclo celular podem ser realizados por análise da citometria de fluxo em células coradas com marcadores fluorescentes ligantes do DNA, tais como iodeto de propídeo. As células apoptóticas podem ser identificadas com marcadores fluorescentes, tais como anexina V, que se liga a fosfolipídios anormalmente expostos na superfície das células mortas. Os citômetros de fluxo modernos podem detectar rotineiramente três ou mais diferentes sinais fluorescentes coloridos, cada um ligado a um diferente anticorpo ou marcador. Esta técnica permite a análise simultânea da expressão, pela célula, de muitas combinações diferentes de moléculas. Em adição à detecção de sinais fluorescentes, os citômetros de fluxo também medem as propriedades das células e a dispersão da luz, o que reflete o tamanho celular e a complexidade interna, respectivamente. Essa informação frequentemente é usada para distinguir diferentes tipos celulares. Por exemplo, comparados com os linfócitos, os neutrófilos induzem maior desvio lateral por causa dos seus grânulos citoplasmáticos e os monócitos provocam maior desvio para trás por causa do seu tamanho.

FIGURA A-4 Princípio da citometria de fluxo e separação celular por fluorescência.
Aincidência de feixe de luz é de um comprimento de onda designado e a luz que emerge de volta da amostra e a dispersão lateral são analisadas, assim como a luz fluorescente de dois ou mais comprimentos de onda que depende dos marcadores de fluorocromo ligados aos anticorpos. A separação mostrada aqui é baseada nos dois marcadores antigênicos (separação de duas cores). Os instrumentos modernos podem analisar rotineiramente e separar populações celulares baseando-se em três ou mais marcadores de diferentes cores. 

Uma tecnologia baseada em anticorpo e recentemente desenvolvida, denominada citometria de massa, combina a tecnologia de fluxo de uma única célula, dos citômetros de fluxo, com a espectrometria de massa. O dispositivo comercialmente disponível usado para este fim é denominado CyTOF, com “TOF” indicando que ele é um citômetro de massa do tipo tempo de voo. Anticorpos específicos para moléculas de interesse são marcadas com qualquer um de um grande número de metais pesados, usando um metal diferente para cada especificidade de anticorpo. Esses anticorpos são incubados com a população celular em estudo, e as células são analisadas por um instrumento CyTOF que realiza a espectrometria de massa em células individuais. Ao contrário dos marcadores fluorescentes, muitos e diferentes marcadores de metais pesados podem ser resolvidos pela espectrometria de massa sem sobreposição, permitindo a detecção de cerca de 100 moléculas diferentes em uma única célula.

Purificação de Células 

O classificador de células ativado por fluorescência é uma adaptação da citometria de fluxo que permite a separação de populações celulares levando em conta o tipo e a quanto marcador fluorescente elas podem se ligar. Esta técnica é realizada mediante desvio diferencial das células com campos eletromagnéticos cujo comprimento e direção são variados de acordo com a intensidade medida do sinal fluorescente (Fig. A-4). As células podem ser marcadas com anticorpos marcados ex vivo com fluorescência ou, em casos de estudos experimentais com animais, a marcação pode ser feita in vivo com a expressão de transgenes que codificam proteínas fluorescentes, tais como a proteína verde fluorescente. (A tecnologia transgênica é descrita mais adiante neste apêndice.)
Outra técnica comumente utilizada para purificar células com um fenótipo em particular depende dos anticorpos que estão ligados às partículas magnéticas. Esses “reagentes imunomagnéticos” se ligarão a certas células, dependendo da especificidade do anticorpo utilizado, e as células ligadas podem então ser retiradas da suspensão com uso de um magneto forte.

Imunofluorescência e Imuno-Histoquímica 

Os anticorpos podem ser utilizados para identificar a distribuição anatômica de um antígeno dentro de um tecido ou de compartimentos celulares. Para fazer isso, o tecido ou célula é incubado com um anticorpo que está marcado com um fluorocromo ou enzima e a posição do marcador, determinada com um microscópio apropriado, é usada para inferir a posição do antígeno. Na versão mais antiga deste método, chamada de imunofluorescência, o anticorpo era marcado com um corante fluorescente e incubado para se ligar a uma monocamada de células ou a uma seção congelada de tecido. As células ou tecidos corados eram examinados com um microscópio de fluorescência para localizar o anticorpo. Embora sensível, o microscópio de fluorescência não é uma ferramenta ideal para a identificação de estruturas celulares ou teciduais detalhadas em virtude de uma baixa razão sinal-ruído. Este problema tem sido superado com novas tecnologias, incluindo a microscopia confocal, que utiliza tecnologia de seccionamento ótico para filtrar a luz fluorescente não focalizada; e o microscópio de dois fótons, que impede que se forme luz fora de foco. Alternativamente, anticorpos podem ser acoplados a enzimas que convertem substratos incolores a substâncias coloridas insolúveis que precipitam na posição da enzima. Um microscópio de luz convencional pode, então, ser utilizado para localizar o anticorpo em uma célula ou tecido corados. A variante mais comum deste método utiliza a enzima horseradish peroxidase, e o método é comumente nomeado como técnica da imunoperoxidase. Outra enzima comumente utilizada é a fosfatase alcalina. Diferentes anticorpos acoplados a diferentes enzimas podem ser utilizados em conjunto para produzir localizações simultâneas com duas cores para distintos anticorpos. Em outras variações, o anticorpo pode ser acoplado a um marcador eletrodenso, como ouro coloidal, e a localização do anticorpo pode ser determinada subcelularmente com o uso de um microscópio eletrônico, uma técnica denominada microscopia imunoeletrônica. Partículas de ouro de diferentes tamanhos têm sido usadas para a localização simultânea de diferentes antígenos em níveis ultraestruturais.
 Em todos os métodos imunomicroscópicos, sinais podem ser aumentados com o uso de técnicas de sanduíche. Por exemplo, em vez de se ligar a horseradish peroxidase a um anticorpo específico de camundongo direcionado contra o antígeno de interesse, ele pode ser ligado a um segundo antianticorpo (p. ex., anticorpo Ig de coelho contra camundongo) que é utilizado para se ligar ao primeiro anticorpo marcado. Quando o marcador é ligado diretamente ao anticorpo primário específico, o método é dito como sendo direto; quando o marcador é ligado a um anticorpo secundário ou mesmo terciário, o método é dito como sendo indireto. Em alguns casos, moléculas diferentes do anticorpo podem ser usadas nos métodos indiretos. Por exemplo, a proteína A estafilocócica, que se liga à IgG, ou avidina, que se liga aos anticorpos primários marcados com biotina, podem ser acopladas a fluorocromo ou enzimas.

Medida de Interações Antígeno-Anticorpo 

Em muitas situações, é importante conhecer a afinidade de um anticorpo pelo antígeno. Por exemplo, a utilidade de um anticorpo monoclonal como um reagente experimental ou terapêutico depende de sua afinidade. As afinidades do anticorpo por um antígeno podem ser medidas diretamente para pequenos antígenos (p. ex., haptenos) por um método denominado diálise de equilíbrio (Fig. A-5). Neste método, uma solução de anticorpo é confinada dentro de uma membrana “semipermeável” de celulose porosa e imersa em uma solução contendo o antígeno. (Semipermeável neste contexto significa que pequenas moléculas, tais como um antígeno, podem passar livremente através dos poros da membrana, mas as macromoléculas, tais como o anticorpo, não passam.) Se nenhum anticorpo estiver presente dentro do compartimento da membrana, o antígeno na solução do banho entra até que a concentração do antígeno dentro do compartimento da membrana se torne exatamente a mesma da do lado externo. Outra maneira de ver o sistema é que, no equilíbrio dinâmico, os antígenos entram e saem do compartimento exatamente na mesma razão. Entretanto, quando o anticorpo está presente dentro da membrana, a quantidade de antígeno dentro da membrana no equilíbrio aumenta pela quantidade que está ligada ao anticorpo. Este fenômeno ocorre porque somente o antígeno não ligado pode difundir através da membrana, e no equilíbrio, esta é a concentração de antígeno não ligado que deve ser idêntica dentro e fora da membrana. A extensão do aumento no antígeno dentro da membrana depende da concentração do antígeno, na concentração de anticorpo, e da constante de dissociação (Kd ) da interação da ligação. O Kd pode ser calculado pela medida das concentrações de antígeno e anticorpo, por espectroscopia, ou de outras maneiras.

FIGURA A-5 Análise de ligação antígeno-anticorpo por diálise de equilíbrio.
 Na presença do anticorpo (B), a quantidade de antígeno dentro da membrana de diálise é aumentada em comparação com a ausência de anticorpo (A). Como descrito no texto, essa diferença, causada pela ligação do anticorpo ao antígeno, pode ser usada para medir a afinidade do anticorpo ao antígeno. Este experimento pode ser realizado somente quando o antígeno é uma molécula pequena (p. ex., um hapteno capaz de cruzar livremente a membrana de diálise).

Fonte: Livro Imunologia Celular e Molecular - 8ª Ed.

Autores: Abul Lichtman, Andrew Abbas

Uma maneira alternativa de determinar o Kd é pela medição das taxas de formação e dissociação do complexo antígeno-anticorpo. Estas taxas dependem, em parte, das concentrações de anticorpo e antígeno e da afinidade desta interação. Todos os parâmetros, exceto as concentrações, podem ser resumidos como razões constantes, e ambas razão constante (Kon ) e razão sem constante (Koff ) podem ser calculadas experimentalmente com a determinação das concentrações e taxas reais de associação ou dissociação, respectivamente. A razão de Koff /Kon permite anular todos os parâmetros não relacionados com a afinidade e é exatamente igual à constante de dissociação Kd . Assim, pode-se medir Kd no equilíbrio com a diálise de equilíbrio ou calcular o Kd a partir de taxas constantes de medidas sob condições sem equilíbrio.
Outro método, mais comumente utilizado, para medir as cinéticas das interações antígeno-anticorpo depende da ressonância do plásmon da superfície. Neste método, um instrumento biossensor especializado (p. ex., Biacore) utiliza um método ótico para medir a afinidade de um anticorpo que é passado por um antígeno que está imobilizado sobre um filme de metal. Uma fonte de luz é focalizada neste filme através de um prisma e em um ângulo específico (ressonância), e a luz refletida fornece uma leitura da ressonância do plásmon da superfície. A adsorção de um anticorpo a um antígeno altera a leitura da ressonância da superfície, e essa alteração pode fornecer informações sobre a afinidade.

Camundongos transgênicos e alvo em gene 

Três importantes e relacionados métodos para o estudo dos efeitos funcionais de produtos específicos de genes, in vivo, são a criação de camundongos transgênicos convencionais que expressam ectopicamente um gene particular em um tecido definido; a criação de camundongos knockout para um gene, na qual uma ruptura direcionada é utilizada para interromper a função de um gene particular; e a geração de camundongos knockin nos quais um gene existente é substituído por uma versão modificada do mesmo. O procedimento do knockin poderia substituir uma versão normal do gene com uma versão mutante ou, a princípio, “corrigir” um gene mutante existente com uma versão “normal”. Estas técnicas envolvendo camundongos geneticamente modificados têm sido muito utilizadas para analisar vários fenômenos biológicos, incluindo desenvolvimento, ativação e tolerância de linfócitos.
 Para a criação de camundongos transgênicos convencionais, sequências estranhas de DNA, denominadas como transgenes, são introduzidas no pró-núcleo de óvulos fertilizados de camundongos, e os óvulos são implantados nos ovidutos de fêmeas pseudográvidas. Normalmente, se uma centena de cópias de um gene for injetada no pró-núcleo, cerca de 25% dos camundongos que nascerem serão transgênicos. Uma a 50 cópias de um transgene são inseridas em conjunto em um local aleatório de quebra no cromossoma e subsequentemente herdadas como traço mendeliano simples. Pelo fato de a integração normalmente ocorrer antes da replicação do DNA, a maioria (cerca de 75%) dos filhos transgênicos carreia o transgene em todas as suas células, incluindo as células germinativas. Na maioria dos casos, a integração do DNA estranho não interrompe o gene endógeno. Além disso, cada camundongo que carreia o transgene é um heterozigoto, do qual linhas homozigóticas podem ser produzidas.
O grande valor da tecnologia transgênica reside no fato de que ela pode ser usada para expressar genes em tecidos em particular por meio da ligação de sequências que codificam o gene das sequências regulatórias que normalmente direcionam a expressão de genes seletivos naquele tecido. Por exemplo, promotores e amplificadores linfoides podem ser usados para superexpressar genes, tais como os genes reorganizados para receptor de antígeno, em linfócitos, e o promotor da insulina pode ser utilizado para expressar genes nas células β das ilhotas pancreáticas. Exemplos da utilidade destes métodos para o estudo do sistema imune são mencionados em muitos capítulos deste livro. Transgenes também podem ser expressos sob controle de elementos promotores que respondem a fármacos e hormônios, tais como a tetraciclina e os estrogênios. Nestes casos, a transcrição do transgene pode ser controlada à vontade pela administração do agente indutor.
 Um método poderoso para o desenvolvimento de modelos animais de distúrbios em um único gene, e a maneira mais definitiva para estabelecer a função de um gene in vivo, é a criação de camundongos knockout com mutação ou rompimento direcionado de um gene. Esta técnica se baseia no fenômeno da recombinação homóloga. Se um gene exógeno é inserido em uma célula, por exemplo, por eletroporação, ele pode se integrar randomicamente dentro do cromossoma da célula. Entretanto, se o gene contiver sequências que são homólogas a um gene endógeno, ele irá se recombinar preferencialmente e substituir sequências endógenas. Para selecionar células que passaram por recombinação homóloga, uma estratégia de seleção baseada em um fármaco é utilizada. O fragmento de DNA homólogo a ser inserido na célula é colocado em um vetor que contém tipicamente o gene de resistência a neomicina e um gene viral de timidina quinase (tk) (Fig. A-6, A). Este vetor-alvo é construído de tal forma que o gene de resistência à neomicina sempre é inserido dentro do DNA cromossômico, mas o gene tk é perdido sempre que ocorrer uma recombinação homóloga (em oposição à inserção randômica). Este vetor é introduzido nas células, e as células são postas a crescer em neomicina e ganciclovir, um fármaco que é metabolizado pela timidina quinase para gerar um produto letal. As células nas quais o gene está integrado randomicamente serão resistentes à neomicina, mas serão mortas pelo ganciclovir, ao passo que as células nas quais a recombinação homóloga tiver ocorrido serão resistentes a ambos os fármacos porque o gene tk não será incorporado. Esta seleção positiva-negativa garante que o gene inserido nas células sobreviventes passará por recombinação homóloga com sequências endógenas. A presença do DNA inserido no meio de um gene endógeno normalmente rompe as sequências de codificação e anula a expressão ou função daquele gene. Além disso, vetores-alvo podem ser designados de maneira que a recombinação homóloga venha a levar à deleção de um ou mais éxons do gene endógeno.

FIGURA A-6 Geração de gene knockout. A, Aquebra do gene X em uma célula-tronco embrionária (ES) é acompanhada por recombinação homóloga. Uma população de células ES é transfectada com um vetor-alvo que contém sequências homólogas de dois éxons do gene X com o gene de resistência à neomicina (neo). O gene neo substitui ou rompe um dos éxons do gene X na recombinação homóloga. O gene de timidina quinase (tk) no vetor será inserido no genoma somente se ocorrer recombinação randômica não homóloga. B, As células ES que foram transfectadas pelo vetor-alvo são selecionadas por neomicina e ganciclovir, de maneira que somente aquelas células com a inserção-alvo (recombinação homóloga) sobrevivem. Estas células são então inseridas em blastocistos, que são implantados no útero de fêmea de camundongo pseudográvida. Um camundongo quimérico se desenvolverá de tal forma que alguns tecidos serão derivados das células ES que carreiam a mutação-alvo no gene X. Estes camundongos quiméricos são identificados por uma mistura de cores, incluindo a cor dos camundongos dos quais as células ES foram derivadas e a cor da linhagem dos camundongos dos quais o blastocisto foi derivado. Se a mutação estiver presente nas células germinativas, ela pode ser propagada nas linhadas subsequentes.

Para gerar um camundongo que carreie um gene-alvo rompido ou mutado, um vetoralvo é usado para primeiro romper o gene em uma linhagem de célula-tronco embrionária murina (ES). As células ES são células pluripotentes derivadas de embriões de camundongo que podem ser propagadas e induzidas a se diferenciar em cultura ou que podem ser incorporadas em um blastocisto de camundongo, o qual pode ser implantado em uma mãe pseudográvida que o geste a termo. Resssalta-se que a progênie das células ES se desenvolverá normalmente em tecidos maduros que expressarão os genes endógenos que foram transfectados para as células ES. Assim, o vetor-alvo designado para romper um gene em particular é inserido nas células ES, e colônias nas quais a recombinação homóloga ocorreu (em um cromossoma) são selecionadas com fármacos, como descrito anteriormente (Fig. A-6, B). A presença da recombinação desejada é verificada pela análise do DNA com técnicas como hidribização por Southern blot ou reação em cadeia da polimerase. As células ES selecionadas são injetadas em blastocistos, que são implantados em fêmeas pseudográvidas. Os camundongos que se desenvolvem serão quiméricos para a quebra ou mutação heterozigótica, ou seja, alguns dos tecidos serão derivados das células ES e outros do blastocisto normal remanescente. As células germinativas normalmente também são quiméricas, mas pelo fato de serem haploides, somente algumas conterão a cópia do cromossoma com o gene rompido (mutado). Se os camundongos quiméricos forem mantidos juntos com animais normais (selvagens) e o esperma, ou óvulos, contendo o cromossoma se fundir com o parceiro selvagem, todas as células da descendência derivada de tal zigoto serão heterozigóticas para a mutação (a chamada transmissão da linha germinativa). Esses camundongos heterozigotos podem ser acasalados para obtenção de animais que serão homozigotos para a mutação com uma frequência que é previsível por segregação mendeliana simples. Tais camundongos knockout são deficientes na expressão do gene-alvo.
A recombinação homóloga também pode ser usada para substituir uma sequência normal de gene com uma versão modificada do mesmo gene (ou outro gene), criando, assim, uma linhagem de camundongo knockin. Os camundongos knockin podem ser utilizados para avaliar as consequências biológicas de uma alteração em uma base simples, por exemplo, ao contrário da deleção de um gene. A abordagem knockin poderia, a princípio, também ser usada para substituir um gene defeituoso por um normal. Em certas circunstâncias, um gene diferente pode ser colocado em um local definido em um genoma por meio do uso de estratégia de knockin em vez de em um local randômico, como nos camundongos transgênicos convencionais. As abordagens knockin são usadas quando é desejável ter a expressão do transgene regulado por certas sequências endógenas de DNA, tais como uma região amplificadora ou promotora em particular. Neste caso, o vetor-alvo contém um gene exógeno que codifica um produto desejado, bem como sequências homólogas a um gene endógeno que são necessárias para direcionar o local da recombinação. Embora a estratégia de alvo gênico convencional tenha provado ser de grande utilidade na pesquisa em Imunologia, a abordagem tem algumas limitações. Primeiro, a mutação de um gene durante o desenvolvimento pode ser compensada pela expressão alterada de outros produtos gênicos e, assim, a função do gene-alvo pode ser obscurecida. Segundo, em um camundongo knockout convencional, a importância de um gene em somente um tecido ou em um único momento durante o desenvolvimento não pode ser facilmente avaliada. Terceiro, um gene marcado por seleção funcional, tal como o gene de resistência à neomicina, é permanentemente introduzido no genoma do animal e esta alteração pode ter resultados imprevisíveis no fenótipo do animal. Um refinamento importante da tecnologia de gene knockout que pode superar muitas destas desvantagens é a abordagem de alvo “condicional”. Uma estratégia condicional comumente utilizada tira vantagem do sistema de recombinação de Cre/loxP derivado de bacteriófago. A enzima Cre é uma DNA recombinase que reconhece um motivo de sequência de 34-bp denominado loxP, e a enzima medeia a deleção dos segmentos de gene flanqueado por dois locais loxP na mesma orientação. Para gerar camundongos com genes loxP, vetores são construídos com um local loxP flanqueando o gene de resistência à neomicina em uma terminação e um segundo local loxP flanqueando as sequências homólogas ao alvo na outra terminação. Estes vetores são transfectados nas células ES, e os camundongos que carreiam o loxP mas ainda possuem o gene-alvo funcional são gerados como descritos para os camundongos knockout convencionais. Uma segunda cepa de camundongos carreando o transgene cre é, então, criada com a cepa que carreia o gene-alvo loxP (floxed). Na prole, a expressão de Cre recombinase irá mediar a deleção do gene-alvo. Ambas as sequências de gene normal e de gene de resistência à neomicina serão deletadas. Ressalta-se que a expressão do gene cre, e assim a deleção do gene-alvo, pode ser restrita a certos tecidos ou tempos especificados com o uso de construções de transgene cre com diferentes promotores. Por exemplo, a deleção seletiva de um gene somente em macrófagos e granulócitos pode ser acompanhada pelo uso de camundongo transgênico em cre no qual cre é direcionado pelo promotor lisozima, ou a perda seletiva de um gene somente nas células T regulatórias pode ser acompanhada usando o promotor foxp3 que direciona o transgene cre. Alternativamente, um promotor induzido por esteroide pode ser usado de forma que a expressão de Cre e subsequente deleção do gene ocorram somente após os camundongos receberem uma dose de dexametasona. Muitas outras variações nesta tecnologia foram desenvolvidas para criar mutantes condicionais. A tecnologia Cre/loxP também pode ser usada para criar camundongos knockin. Neste caso, os locais loxP são colocados no vetor-alvo para flanquear o gene de resistência à neomicina e as sequências homólogas, mas eles não flanqueiam a substituição (knockin) de sequências de genes. Dessa maneira, após a deleção mediada por cre, o gene exógeno permanece no genoma no local alvo. A tecnologia de gene knock in tem sido aplicada para criar camundongos “repórteres” nos quais as células que normalmente expressariam uma proteína em particular expressam uma molécula fluorescente no mesmo local de uma proteína nativa. Isso é realizado com a substituição do gene nativo por um transgene que codifica uma proteína repórter fluorescente e a proteína nativa, ambas sob o controle do promotor e amplificador nativos. Os camundongos “repórteres” foram desenvolvidos para permitir a visualização de células imunes de subgrupos particulares in vivo, tais como camundongos nos quais as células Th17 produtoras de IL-17 também expressam uma proteína fluorescente. Estas células podem ser detectadas utilizando-se microscópio de fluorescência intravital. As células que expressam os genes “repórteres” também podem ser isoladas vivas e submetidas a estudos funcionais ex vivo, mesmo que o gene “repórter” nativo seja um fator de transcrição nuclear cuja expressão poderia ser somente detectável por métodos que matam as células. Por exemplo, células T regulatórias vivas podem ser isoladas por FACS a partir de linfonodos de um camundongo “repórter” que expressa a proteína verde fluorescente simultaneamente com o fator de transcrição FoxP3. Uma nova abordagem para gerar mutações nas linhagens celulares, assim como nas células ES, utiliza uma modificação do sistema de defesa bacteriano contra DNA estranho denominada sistema CRISPR (repetições palindrômicas curtas de interespaços regularmente agrupados, do inglês clustered regularly interspaced short palindromic repeats) Cas9 (nuclease 9 associada a CRISPR). Na variação da edição do gene, um guia de RNA hibridiza com uma sequência de DNA alvo escolhida e permite que a Cas9 nuclease gere uma quebra da fita dupla escolhida. Enquanto a quebra pode romper o gene, a cotransfecção do plasmídeo com a versão mutada da sequência-alvo permite uma recombinação homóloga eficiente e a criação de uma mutação knockin alvo. Esta é a abordagem mais rápida e disponível para a geração de mutações knockout ou knockin em linhagens celulares ou em linhagens germinativas de animais experimentais.
 Métodos para o estudo das respostas de linfócitos T Nosso conhecimento atual sobre os eventos celulares na ativação da célula T se baseia em uma variedade de técnicas experimentais nas quais diferentes populações de células T são ativadas por um estímulo definido e as respostas funcionais são medidas. Experimentos in vitro forneceram uma grande quantidade de informações sobre as mudanças que ocorrem em uma célula T quando ela é estimulada pelo antígeno. Mais recentemente, várias técnicas foram desenvolvidas para estudar a proliferação da célula T, expressão de citocina e redistribuição anatômica em resposta à ativação in vivo pelo antígeno. Os novos procedimentos experimentais são particularmente úteis para o estudo da ativação de células T inativas e localização de células T de memória específica para antígeno após uma resposte imune ter diminuído. Ativação Policlonal de Células T Os ativadores policlonais de células T se ligam a muitos ou todos os complexos de receptores de células T (TCR) independentemente da especificidade e ativam as células T de forma similar aos complexos MHC-peptídio nas células apresentadoras de antígenos (APCs). Os ativadores policlonais são mais comumente usados in vitro para ativar células T isoladas de sangue humano ou de tecidos linfoides de animais experimentais. Os ativadores policlonais também podem ser usados para ativar células T com especificidades desconhecidas de antígenos, e eles podem evocar uma resposta detectável em populações misturadas de células T inativas, embora a frequência das células específicas para qualquer antígeno seja muito baixa para elicitar uma resposta detectável. As proteínas de plantas que são ligantes de carboidratos poliméricos, denominadas lectinas, tais como a concanavalina A e a fito-hemaglutinina, são o grupo mais comumente utilizado de ativadores policlonais de célula T. Estas lectinas se ligam especificamente a certos resíduos de açúcar nas glicoproteínas da superfície da célula T, incluindo o TCR e as proteínas CD3 e, assim, estimulam as células T. Anticorpos específicos para uma malha invariante de epítopos nas TCR e proteínas CD3 também funcionam como ativadores policlonais das células T. Com frequência, esses anticorpos necessitam ser imobilizados em superfícies sólidas ou partículas ou fazem ligação cruzada com antianticorpos secundários para induzir respostas de ativação ótima. Pelo fato de os ativadores policlonais não fornecerem sinais coestimuladores que sejam normalmente transmitidos pelas APCs, eles são frequentemente utilizados em conjunto com anticorpos estimulatórios para receptores para coestimuladores, tais como antiCD28 ou anti-CD2. Superantígenos, outro tipo de estímulo policlonal, se ligam e ativam todas as células T que expressam tipos particulares de cadeia TCR β (Fig. 16-2). Células T de qualquer especificidade de antígeno também podem ser estimuladas com reagentes farmacológicos, tais como a combinação de forbol éster PMA e ionóforo de cálcio ionomicina, que mimetiza sinais gerados pelo complexo TCR. Ativação Induzida por Antígeno de Populações Policlonais de Célula T As populações policlonais de células T normais que são enriquecidas com células T específicas para um antígeno em particular podem ser derivadas do sangue e órgãos linfoides periféricos de indivíduos após imunização com o antígeno. A imunização serve para expandir o número de células T específicas para o antígeno, as quais podem, então, ser reestimuladas in vitro com adição de antígeno e APCs combinadas com MHC para as células T. Este procedimento pode ser usado para estudar a ativação induzida por antígeno de uma população misturada de células T previamente ativadas prime e que expressam muitos TCRs diferentes, mas o método não permite a análise das respostas de células T inativas. Ativação Induzida por Antígeno de Populações de Células T com Especificidade Antigênica Simples As populações monoclonais de células T, que expressam TCRs idênticos, têm sido úteis para análises funcionais, bioquímicas e moleculares. A limitação destas populações monoclonais é que elas são mantidas como linhagens de cultura de tecidos de longo prazo e, assim, podem divergir fenotipicamente de células T normais in vivo. Um tipo de população de célula T monoclonal que é frequentemente usado na Imunologia experimental é o clone de célula T específico para antígeno. Tais clones são derivados do isolamento das células T de indivíduos imunizados, como descrito para células T policlonais, seguido por repetições in vitro com o antígeno estimulante mais APCs ligados a MHC e clonagem de células responsivas a antígenos em meio semissólido ou em meio líquido e por diluição limitada. Respostas específicas para antígenos podem ser facilmente medidas nestas populações porque todas as células em uma linhagem celular clonada têm os mesmos receptores e foram selecionadas para o crescimento em resposta a um complexo antígeno-MHC conhecido. Ambos os linfócitos T auxiliares e citotóxicos foram estabelecidos a partir de camundongos e humanos. Outras populações de células T monoclonais usadas no estudo da ativação da célula T incluem os hibridomas de células T específicas para antígeno, que são produzidas como hibridomas de célula B (Fig. 5-9), e linhagens tumorais derivadas de células T foram estabelecidas in vitro após a remoção das células T malignas de animais ou humanos com leucemias ou linfomas de célula T. Embora algumas linhagens derivadas de tumores expressem complexos TCR funcionais, suas especificidades de antígenos são desconhecidas e as células normalmente são estimuladas com ativadores policlonais para objetivos experimentais. A linhagem Jurkat, derivada de célula de leucemia de célula T humana, é um exemplo de uma linhagem tumoral que é amplamente utilizada como modelo para o estudo da transdução de sinal em célula T. Os camundongos transgênicos TCR são uma fonte de células T homogêneas, fenotipicamente normais, com especificidades antigênicas idênticas e que são grandemente utilizadas para análises experimentais in vitro e in vivo. Se as cadeias gênicas α e β reorganizadas de TCR simples de especificidade específica são expressas como transgene em camundongos, a maioria das células T maduras nos camundongos expressará o TCR. Se o transgene TCR é cruzado com uma deficiência em RAG-1 ou RAG- 2, nenhuma expressão de gene TCR ocorrerá e 100% das células T expressarão somente TCR transgênico. As células T transgênicas em TCR podem ser ativadas in vitro ou in vivo com um antígeno peptídico único e podem ser identificadas por anticorpos específicos para o TCR transgênico. Uma das únicas vantagens dos camundongos transgênicos em TCR é que eles permitem o isolamento de número suficiente de células T inativas de especificidades específicas para permitir o estudo funcional de respostas à primeira exposição ao antígeno. Esta vantagem permitiu aos investigadores o estudo das condições in vitro sob as quais a ativação pelo antígeno de células T inativas leva à diferenciação em subgrupos funcionais tais como células TH1 e TH2 (Cap. 9). As células T imaturas de camundongos transgênicos em TCR também podem ser injetadas em camundongos recebedores singênicos, onde eles são base para os tecidos linfoides. O camundongo recebedor é, então, exposto ao antígeno para o qual o TCR transgênico é específico. Por meio do uso de anticorpos que marcam as células T TCR transgênicas, é possível acompanhar a expansão e diferenciação in vivo e isolá-las para análise das respostas secundárias ao antígeno ex vivo. Métodos para Enumeração e Estudo de Respostas Funcionais de Células T Ensaios de proliferação para linfócitos T, semelhantes àqueles de outras células, são conduzidos in vitro com a determinação da quantidade de 3H-timidina incorporada no DNA das células replicantes em cultura. A incorporação de timidina fornece uma medida quantitativa da taxa de síntese de DNS, que, em geral, é diretamente proporcional à taxa de divisão celular. A proliferação celular in vivo pode ser medida pela injeção do análogo de timidina bromodeoxiuridina (BrdU) em animais e coloração das células com anticorpo anti-BrdU para a identificação e enumeração dos núcleos que incorporaram o BrdU em seu DNA durante a replicação do DNA. Corantes fluorescentes podem ser usados para o estudo da proliferação das células T in vivo. As células T são primeiramente marcadas com ésteres fluorescentes lipofílicos quimicamente reativos e, então, transferidas para os animais experimentais. Os corantes entram nas células, formam ligações covalentes com proteínas citoplasmáticas e, então, não mais saem das células. Um corante deste tipo e comumente utilizado é o éster de succinimidil 5,6-carboxifluoresceína diacetato (CSFE), que pode ser detectado nas células por técnicas de citometria de fluxo padrão. Cada vez que uma célula T se divide, seu conteúdo de corante é reduzido à metade, sendo possível determinar se as células T transferidas presentes em tecidos linfoides de um camundongo recebedor se dividiram in vivo e estimar o número de duplicações pelo qual cada célula T passou. Os tetrâmeros peptídio-MHC são usados para enumerar células T com uma única especificidade antigênica isolados de sangue ou tecidos linfoides de animais experimentais ou humanos. Estes tetrâmeros contêm quatro dos complexos peptídioMHC que a célula T pode normalmente reconhecer na superfície das APCs. O tetrâmero é feito pela produção de uma molécula de MHC de classe I na qual é ligada uma pequena molécula, denominada como biotina, com o uso de tecnologia de DNA recombinante. A biotina se liga com alta afinidade a uma proteína denominada avidina, e cada molécula de avidina se liga a quatro moléculas de biotina. Então, a avidina forma um substrato para montagem de quatro proteínas de MHC conjugadas com biotina. As moléculas de MHC podem ser carregadas com um peptídio de interesse e estabilizadas, e a molécula de avidina é marcada com um fluorocromo (p. ex., FITC). Este tetrâmero se liga a células T específicas para o complexo peptídio-MHC com avidez grande o suficiente para marcar as células T, mesmo em suspensão. Este método é o único procedimento viável para a identificação de células T antígeno-específicas, em humanos. Por exemplo, é possível identificar e enumerar as células T restritas para HLA-A2 e específicas para um peptídio de HIV com coloração das células sanguíneas com um tetrâmero de moléculas de HLAA2 carregadas com o peptídio. A mesma técnica tem sido utilizada para enumerar e isolar células T específicas para os próprios antígenos em indivíduos normais e em pacientes com doenças autoimunes. Tetrâmeros peptídio-MHC que se ligam a um TCR transgênico particular também podem ser usados para quantificar as células T transgênicas em diferentes tecidos após a transferência adotiva e estimulação do antígeno. Atualmente, a técnica é muito utilizada com moléculas de MHC de classe I; nas moléculas de classe I, somente um polipeptídio é polimórfico e moléculas estáveis podem ser produzidas in vitro. Isso é mais difícil para as moléculas de classe II porque ambas as cadeias são polimórficas e necessitam de uma montagem correta, mas os tetrâmeros de peptídios classe II também têm sido produzidos. Os ensaios de secreção de citocina podem ser usados para quantificar as células T efetoras e secretoras de citocinas dentro dos tecidos linfoides. Os métodos mais comumente utilizados consistem na coloração citoplasmática de citocinas e nos ensaios de única célula e imunossorventes ligados à enzima (ELISpot). Nestes tipos de estudos, a ativação e diferenciação de células T induzidas por antígeno ocorrem in vivo e, então, as células T são isoladas e testadas para expressão in vitro de citocinas. A coloração citoplasmática de citocinas necessita de permeabilização das células de modo que os anticorpos marcados com fluorocromo e específicos para uma citocina particular possam entrar nas células e as células coradas sejam, então, analisadas por citometria de fluxo. A expressão de citocina pelas células T específicas para um antígeno em particular pode ser determinada por coloração adicional das células T com tetrâmeros peptídio-MHC ou, no caso das células T TCR transgênicas, anticorpos específicos para TCR transgênico. Com o uso de uma combinação de CFSE e anticorpos anticitocina, é possível examinar a relação entre a divisão celular e a expressão de citocina. No ensaio de ELISpot, as células T recentemente isoladas de sangue ou tecidos linfoides são cultivadas em poços plásticos recobertos com anticorpo específico para uma citocina em particular. À medida que as citocinas são secretadas das células T individuais, elas se ligam aos anticorpos em pontos discretos e correspondentes à localização de células T individuais. Os pontos são visualizados pela adição de uma enzima secundária ligada à anti-Ig, como em um ELISA padrão (ver anteriormente), e o número de pontos é contado para se determinar a quantidade de células T secretoras de citocina.

Métodos para o estudo das respostas de linfócitos B Ativação de Populações de Células B Policlonais É tecnicamente difícil estudar os efeitos dos antígenos em células B porque, como prediz a hipótese da seleção clonal, muito poucos linfócitos em um indivíduo são específicos para qualquer antígeno. Uma abordagem para evitar esse problema é o uso de anticorpos anti-Ig como análogos dos antígenos, assumindo-se que o anti-Ig se ligará às regiões constantes (C) das moléculas Ig da membrana em todas as células B e terá os mesmos efeitos biológicos do antígeno que se liga às regiões hipervariáveis das moléculas Ig da membrana somente nas células B específicas para o antígeno. Considerando que as comparações precisas são viáveis, esta suposição geralmente parece correta, indicando que o anticorpo anti-Ig é um modelo válido para antígenos. Assim, o anticorpo anti-Ig frequentemente é usado como ativador policlonal dos linfócitos T, similar ao uso de anticorpos anti-CD3 como ativadores policlonais de linfócitos T, discutido anteriormente. Ativação Antígeno-Anticorpo de Populações de Células B com Especificidade Antigênica Simples Para examinar os efeitos da ligação de antígenos às células B, investigadores têm tentado isolar células B específicas para antígenos a partir de populações complexas de linfócitos normais ou produzir linhagens de células B clonais com especificidades antigênicas definidas. Estes esforços têm alcançado pouco sucesso. Entretanto, camundongos transgênicos foram desenvolvidos onde virtualmente todas as células B expressam Ig transgênica de especificidade conhecida, de tal forma que a maioria das células B nestes camundongos responde ao mesmo antígeno. Um procedimento um pouco mais sofisticado foi criado para produzir camundongos knockin em receptor de antígeno, nos quais genes das cadeias H e L de Ig reorganizados foram homologamente recombinados em seu lócus endógeno. Tais animais knockin provaram ser particularmente úteis na verificação da edição de receptor. Métodos para Medidas da Proliferação das Células B e Produção de Anticorpo Muito do nosso conhecimento a respeito da ativação da célula B se baseia nos experimentos in vitro, nos quais diferentes estímulos são usados para ativar células B e sua proliferação e diferenciação podem ser medidas com precisão. Os mesmos ensaios podem ser realizados com células B recuperadas de camundongos expostos a diferentes antígenos ou com células B homogêneas expressando transgene que expressam receptores de antígeno. A proliferação da célula B é medida com o uso de marcação com CFSE ou incorporação de 3H-timidina in vitro e marcação in vivo com BrdU, como descrito anteriormente para a proliferação de células T. A produção de anticorpo é medida de duas maneiras diferentes: com ensaios para a secreção cumulativa de Ig, que mede a quantidade de Ig que se acumula no sobrenadante de linfócitos em cultura ou no soro de um indivíduo imunizado, e com ensaios com uma célula, que determina o número de células em uma população imune que secreta Ig de uma especificidade particular ou isotipo. A técnica mais precisa, quantitativa e utilizada para medir a quantidade total de Ig no sobrenadante de uma cultura ou amostra de soro é o ELISA. Com o uso de antígenos ligados a suportes sólidos, é possível o uso do ELISA para quantificar a quantidade de anticorpo em uma amostra específica para um antígeno em particular. Além disso, a disponibilidade de anticorpos anti-Ig que detectam Igs de distintas classes de cadeias pesada e leve permite a medida de quantidades de isotipos diferentes em uma amostra. Outras técnicas para medir os níveis de anticorpo incluem hemaglutinação para anticorpos antieritrócitos e lise dependente de anticorpo para anticorpos específicos para tipos celulares conhecidos. Ambos os ensaios são baseados na demonstração de que, se a quantidade de antígeno (i.e., células) é constante, a concentração de anticorpo determina a quantidade de anticorpo ligado às células, e isto é refletido no grau de aglutinação celular ou ligação subsequente do complemento e lise celular. Resultados destes ensaios normalmente são expressos como títulos de anticorpos, que são a diluição da amostra que fornece metade dos efeitos máximos ou da diluição na qual se atinge o ponto final do ensaio. O ensaio com uma célula para a secreção de anticorpo é o ensaio de ELISpot. Neste método, o antígeno é ligado ao fundo de um poço, células secretoras de anticorpo são adicionadas e os anticorpos que foram secretados e estão ligados ao antígeno são detectados por um anticorpo anti-Ig ligado a uma enzima, como no ELISA, em um meio semissólido. Cada ponto representa a localização da célula secretora de antígeno. Os ensaios com uma única célula fornecem a medida do número de células secretoras de Ig, mas eles não quantificam com precisão a quantidade de Ig secretada por cada célula da população total. As técnicas de ELISA e ELISpot podem ser adaptadas para avaliar a afinidade dos anticorpos, com o uso de antígenos com números diferentes de conteúdo de hapteno. Dessa maneira, a maturação de afinidade pode ser avaliada com o teste do soro ou de células B coletadas em diferentes momentos durante uma resposta imune.

Fonte: Livro Imunologia Celular e Molecular - 8ª Ed.

Autores: Abul Lichtman, Andrew Abbas